База данных по химическим эффектам в химических патентах

ПРИМЕНЕНИЕ ПЬЕЗОЭЛЕКТРИЧЕСКИХ БИОСЕНСОРОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЕННОГО ДОПИНГА /Русанова Т.a, Minunni M.б, Mascini M.б /аСаратовский государственный университет, Астраханская 83, 410012, Саратов, Россия бУниверситет Флоренции, Via della Lastruccia 3, Sesto Fiorentino, 50019, Италия [18 Менд.съезд, 2007, т.4, с.209]
Допинг в различных формах – серьезная проблема спорта высоких достижений, в связи с чем разработка надежных и удобных методов диагностики допинга у спортсменов является актуальной задачей1. Генный допинг определяется Всемирным антидопинговым агентством (ВА ДА) как нетерапевтическое использование клеток, генов, генетических элементов, модуляции экспрессии генов, способных улучшать спортивный результат[2]. Вирусные векторы являются самыми популярными и эффективными методами доставки генов и наиболее вероятны для использования в целях генного допинга. Генетически измененные вирусы вводятся в организм, где они инфицируют клетки и используют их биохимический механизм для экспрессии трансгена. Таким образом, актуальным является обнаружение присутствия чужеродной ДНК в теле спортсмена для определения нелегальных случаев генной терапии. Нами разработан пьезоэлектрический сенсор для определения гена, кодирующего усиленный зеленый флуоресцирующий белок (eGFP), используемый в качестве маркера переноса генов. Предварительно проведена оптимизация сенсора с использованием синтетических олигонуклеотидов. Две нуклеотидных последовательности, соответственно, из 18 (eGFP1 зонд) и 20 оснований (eGFP2 зонд), выбранные на основе начальной ДНК, были иммобилизованы на поверхность пьезокварца. При этом использовали 2 различных методологии: а) биотинилированные зонды были иммобилизованы посредством взаимодействия биотин-стрептавидин на золотую поверхность сенсора, предварительно модифицированную системой тиол/декстран/стрептавидин; б) тиолированные зонды были иммобилизованы за счет непосредственного связывания групп -SH с золотой поверхностью сенсора[3]. Далее было исследовано определение олигонуклеотидов (0.05–1.00 мкM), комплементарных иммобилизованным на пьезокварце, и изучены аналитические параметры систем. Наилучшие чувствительность и воспроизводимость получены для кристалла, модифицированного биотинилированным зондом eGFP2. Сигнал сенсора в случае 20-мерного некомплементарного олигонуклеотида (1 мкM) был незначительным (<3 Гц), что доказывает специфичность системы. Разработанный сенсор использовали для анализа образцов плазмидной ДНК после ее трансформации в бактериальной среде E.coli и амплификации методом цепной полимеразной реакции. Амплифицированный фрагмент ДНК, входящий в последовательность гена eGFP, состоял из 209 оснований и содержал последовательность, комплементарную иммобилизованному зонду eGFP2. Образцы подвергали денатурации (5 мин при 95°C и 1 мин при 0°C), затем оставляли в контакте с зондом на 20 мин. Полученные результаты продемонстрировали потенциальную возможность использования ДНК-сенсоров для определения таких маркеров, как eGFP, присутствующих в векторах, используемых для генного переноса. | C07B, C07D, c08s, c45be, c90es
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Италии.
Литература 1. H.M.E. Azzazy, M.M.H. Mansour, R.H. Christenson. Clinical Biochemistry 2005, 38, 959.
2. World Anti-doping Agency, 2Hhttp://www.wada-ama.org.
3. H.S. Tombelli, M. Minunni, M. Mascini. Methods 2005, 37, 48.